Costituita nel 1618, è il più antico museo milanese aperto grazie alla donazione del Cardinale Federico Borromeo e arricchito da successivi lasciti. All’epoca della donazione del 1618, si contavano circa 250 dipinti tra originali e copie (una trentina); ora si contano più di 1.500 opere su tavola, su tela e su rame.
Sono visibili capolavori quali il Musico di Leonardo da Vinci, la Madonna del Padiglione di Botticelli, la Canestra di Frutta di Caravaggio e l'Adorazione dei Magi di Tiziano, il grande cartone di Raffaello raffigurante la Scuola di Atene, che presenta alcune piccole varianti rispetto all’affresco vaticano.

La Pinacoteca e la Biblioteca Ambrosiana devono la loro nascita al cardinale Federico Borromeo che aprì la biblioteca nel 1609 e fondò la pinacoteca nel 1618. Tre anni dopo la sua fondazione, la pinacoteca fu ampliata con un'accademia per lo studio di pittura e scultura dove il Cerano fu il primo insegnante. Alla fine del secolo fu istituita una seconda accademia per volere di Antonio Busca e Dionigi Bussola.
La Biblioteca e la Pinacoteca sono sempre state fortemente collegate ed entrambe hanno raccolto opere di epoca umanistica e rinascimentale. Obiettivo del cardinale Borromeo era infatti creare un polo artistico per la diffusione delle arti e per la formazione di chiunque avesse talento e desiderio di apprendere da grandi maestri le arti pittoriche e scultoree. Nel 1637 Galeazzo Arconati donò alla biblioteca i manoscritti di Leonardo, attualmente conservati all'Institute de France.

La collezione presente oggi presso la pinacoteca vanta numerose opere provenienti dall'originale collezione di Borromeo, ampliata nei secoli da numerose altre donazioni.
Tra i suoi tesori anche il Codice Atlantico di Leonardo da Vinci con i suoi 1750 disegni di carattere tecnico-scientifico esposto al pubblico fino al 2015.
Indubbiamente uno dei musei più belli di Milano.
Completato il restauro del Cartone di Raffaello della Scuola di Atene